從獸醫(yī)角度，這是終極研究證據(jù)，因為使用狗作為損傷模型，證明氫水治療有利于皮膚損傷的修復(fù)。當(dāng)然這種研究對于人類醫(yī)學(xué)來說，只能屬于動物實驗層次。
本研究探討了飲用富氫水對犬皮膚傷口愈合的影響。對每只犬的8個圓形傷口進(jìn)行分析。實驗組用富氫水處理，每天3次，對照組用蒸餾水處理。對犬創(chuàng)面組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。用相應(yīng)試劑盒檢測創(chuàng)面皮膚勻漿中成纖維細(xì)胞、炎癥細(xì)胞浸潤、新生血管平均數(shù)量、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活性。采用實時熒光定量法檢測Nrf-2、HO-1、NQO-1、VEGF、PDGF的表達(dá)。我們觀察到，與蒸餾水相比，富氫水傷口的愈合率更高，平均愈合時間更快。組織病理學(xué)顯示，富氫水組的表皮平均厚度明顯低于蒸餾水組，平均血管數(shù)高于蒸餾水組。蒸餾水組MDA水平高于富氫水組，SOD水平低于富氫水組。qRT-PCR結(jié)果顯示，兩組間各基因表達(dá)均有顯著差異。富氫水處理可促進(jìn)犬皮膚創(chuàng)面愈合，加速創(chuàng)面上皮化，減少炎癥反應(yīng)，刺激創(chuàng)面愈合相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，縮短創(chuàng)面愈合時間。 
1.介紹
作為動物最大的器官，皮膚在防止動物致病微生物和創(chuàng)口方面起著至關(guān)重要的作用。由各種因素引起的皮膚傷口通常需要臨床獸醫(yī)處理。嚴(yán)重創(chuàng)傷的恢復(fù)與多種因素有關(guān)，如治療時間和治療策略等，可能導(dǎo)致不同的治療效果，影響傷口愈合的時間和效果。創(chuàng)面愈合涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等一系列機(jī)制，在創(chuàng)面病理生理中起著重要作用。許多治療方法已用于臨床治療，包括光動力治療、遠(yuǎn)紅外治療、脂肪組織提取治療和精氨酸基材料治療，以及基于抗炎治療策略的各種生物材料。
有研究報道，氫氣可以通過抗氧化作用發(fā)揮治療作用。氫氣具有最低的分子量，同時具有強(qiáng)大的抗氧化能力，從體內(nèi)清除過量的活性氧物種(氧自由基)。1975年，DoleM發(fā)現(xiàn)高壓氫氣可以有效治療惡性皮膚腫瘤。臨床研究表明，氫療法在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、帕金森病和代謝綜合征方面具有潛在的治療潛力。Tomohiro等發(fā)現(xiàn)，氫分子可通過誘導(dǎo)HO-1等Nrf-2下游基因，激活Nrf-2抗氧化防御通路，改善高氧誘導(dǎo)的肺損傷。一些研究表明，吸入含氫氣體是臨床護(hù)理的新指南，重點是皮膚傷口的治療。
氫氣是易燃易爆氣體，危險且難以儲存。然而氫飽和水，即所謂的富氫水，安全且容易吸收，經(jīng)常用于醫(yī)學(xué)。據(jù)報道，富氫水具有抗氧化和抗炎作用，降低促炎細(xì)胞因子水平，有效保護(hù)器官免受損傷。羥基自由基和過氧亞硝酸鹽(ONOO-)離子具有很強(qiáng)的氧化毒性，并可引起脂質(zhì)過氧化、DNA損傷和蛋白質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。然而，溶解在水中的氫可以與它們發(fā)生反應(yīng)，減少了隨之而來的損害。當(dāng)氫氣進(jìn)入體內(nèi)并與自由基發(fā)生反應(yīng)，只產(chǎn)生水，排出多余的氫氣。這意味著氫水可以安全地用于治療疾病而不會產(chǎn)生副作用。
以往的動物實驗研究均采用口服富氫水和注射富氫鹽水(HRS)作為氫氣主要給藥途徑。研究表明，富氫鹽水可以通過上調(diào)血紅素加氧酶(HO-1)的表達(dá)以及降低奎寧(NQO-1)來清除過氧化氫和活性氧(ROS)。此外，最近研究已經(jīng)證明富氫水在動物和人類中的抗疲勞作用。富氫水還能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的抗凋亡作用，抑制大鼠腎組織中α、β-二羰基化合物和ROS的產(chǎn)生。另一項研究提示，使用富氫水可提高腭部創(chuàng)面恢復(fù)率。因此，富氫水已被證明是傷口治療的基本治療策略之一。盡管富氫水已被證明可以加速皮膚創(chuàng)傷的恢復(fù)，促進(jìn)大鼠放療引起的皮膚損傷的愈合，但關(guān)于富氫水在犬皮膚創(chuàng)傷中的應(yīng)用的信息很少。
在此，我們旨在探索富氫水是否能在犬模型皮膚傷口的恢復(fù)中發(fā)揮重要作用。這是第一個以獸醫(yī)研究為基礎(chǔ)的研究，目的是評估富氫水對狗皮膚傷口愈合的影響。目的:(1)比較富氫水與蒸餾水處理犬開放性傷口的愈合效果;(2)比較氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo)水平;(3)探討富氫水對犬皮膚創(chuàng)面恢復(fù)是否有治療價值。我們推測，富氫水可促進(jìn)血管生成和提高組織抗氧化基因表達(dá)，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合，加快創(chuàng)面愈合速度，使其成為一種安全有效的臨床治療方法。
2.材料和方法
2.1狗
12只健康雄性小獵犬(年齡:2-4歲;體重:9.0-11.3公斤)，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)，并隨時提供標(biāo)準(zhǔn)的狗糧和水。麻醉前6小時停止進(jìn)食和飲水。所有方法均符合《中華人民共和國動物倫理程序和指南》要求的良好動物規(guī)范。我們盡一切努力減少動物的痛苦，減少動物的數(shù)量。本研究未報告死亡病例，犬的精神狀態(tài)和飲食均正常。實驗結(jié)束后，所有動物均未被宰殺，所有犬均健康，均被動物保護(hù)組織收養(yǎng)。
2.2手術(shù)創(chuàng)口的形成
實驗犬隨機(jī)分為對照組和實驗組(n=6)。第0天在軀干背外側(cè)剪毛。置頭靜脈置管，采用異丙酚(0.65mg/kg)麻醉，氣管插管吸入3.5%異氟醚，術(shù)中實時監(jiān)測實驗犬的生理狀態(tài)。
圖1損傷部位編號。
使用真皮活檢穿孔機(jī)在剃過的背部中線兩側(cè)各創(chuàng)建四個直徑為15毫米的圓形傷口。每個創(chuàng)面距離背中線20mm，相鄰創(chuàng)面距離25mm。從尾部到頭部，從左側(cè)到右側(cè)分別標(biāo)記為A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4(圖1).術(shù)前24小時皮下注射美洛昔康0.1mg/kg，術(shù)后立即注射。每只狗都被關(guān)在一個籠子里，戴著伊麗莎白時代的項圈。創(chuàng)面每日用碘伏消毒。氫氣(99.99%,v/v)，由氫氣發(fā)生器(QL-500;以500mL/min的速度將其沖入400mL蒸餾水中10min達(dá)到飽和。術(shù)后所有犬只均可自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)食物;對照組給予蒸餾水(400mL)，每日3次;試驗組給予飽和富氫水(400mL)，每日3次。每只狗每次只喝一小時的水以保持富氫水濃度不變，另一段時間則不喝水。
在手術(shù)、插管、類似鎮(zhèn)靜和監(jiān)測后7、14、21和28天收集皮膚創(chuàng)面樣本;手術(shù)方式與皮膚創(chuàng)面模型相同，皮膚采用低張力縫合。手術(shù)部位每日用碘伏消毒。第7天取A1、B1處創(chuàng)面;第14天取樣A2和B2，第21天取樣A3和B3，第28天取樣A4和B4。所有的樣本都是用手術(shù)刀提取的。取樣后，用縫線縫合傷口，用碘伏消毒。將A1、A2、A3和A4樣品固定在4%的多聚甲醛中(20g多聚甲醛粉溶解在500mLPBS緩沖液中，然后用磁力攪拌器持續(xù)攪拌。用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH)。B1、B2、B3、B4樣品置于−80℃冰箱中保存。
2.3.皮膚傷口檢查
分別于術(shù)后7、14、21、28d觀察富氫水組和蒸餾水組創(chuàng)面出血情況。觀察包括有無出血，炎癥滲出物特征，傷口愈合，有無傷口感染。在第3、7、14和21天拍攝傷口，并使用ImageJ軟件對傷口進(jìn)行量化。
創(chuàng)面愈合率=(S0−Sn)÷S0×100%
Sn:7、14、21、28天創(chuàng)面面積，S0:0天創(chuàng)面面積。
測量犬皮膚創(chuàng)面愈合情況，直至創(chuàng)面完全被肉芽組織覆蓋;這個過程的時間就是傷口愈合的時間。
石蠟切片用于組織病理學(xué)檢查。H&E染色用于評價上皮厚度和新生血管，Masson染色用于膠原纖維。簡單地說，從每只狗中選擇5個部分，并從每個部分的不同區(qū)域隨機(jī)選擇10個視野。切片評估由兩名獨立的盲法觀察員進(jìn)行。
氧化應(yīng)激檢測采用皮膚組織丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，檢測試劑盒說明(南京建城生物技術(shù)有限公司，南京，中國)。
使用TRIzolReagent(Invitrogen公司，Carlsbad,CA,USA)從皮膚組織中分離總RNA。采用SuperScriptFirstStrandcDNASystem進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用LightCycler480Real-TimePCRSystem進(jìn)行qRT-PCR。
2.4.統(tǒng)計分析
所有數(shù)據(jù)采用獨立樣本進(jìn)行統(tǒng)計分析t-使用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行檢驗。
3.結(jié)果
3.1.傷口愈合
3.1.1臨床傷口評估
圖2顯示，在第3天和第21天，富氫水組和蒸餾水組的皮膚創(chuàng)面面積存在顯著差異。第3天，蒸餾水組皮膚創(chuàng)面出血、水腫、炎癥反應(yīng)明顯，富氫水組皮膚創(chuàng)面不明顯。第7天，富氫水組肉芽組織豐富，新生上皮細(xì)胞豐富，創(chuàng)面濕潤光滑，而蒸餾水組肉芽組織和新生上皮細(xì)胞較少，創(chuàng)面干燥無光，血痂痂大，有炎性滲出物。第14天，所有犬的皮膚組織缺損均充滿肉芽組織;富氫水組比蒸餾水組有更好的再上皮化，出現(xiàn)疤痕組織和毛發(fā)生長。第21天，富氫水組傷口幾乎完全重新上皮化。第28天，富氫水組創(chuàng)面愈合完全，蒸餾水組創(chuàng)面愈合不完全。
圖2實驗組HRW和對照組DW不同時間損傷情況。
3.1.2。傷口愈合率和平均愈合時間
實驗期間，蒸餾水組和富氫水組皮膚創(chuàng)面愈合率逐漸升高，直至完全愈合(圖3,表2)。第3天，富氫水組皮膚創(chuàng)面愈合率(17.57±0.55%)顯著高于蒸餾水組(1.59±0.55%)(p<0.05)。第7天，富氫水組皮膚創(chuàng)面愈合率(46.82±4.29%)顯著高于蒸餾水組(16.44±6.43%)(p<0.01)。平均傷口愈合時間(圖3B,表3)為(19.00±0.36d)，顯著高于蒸餾水組(22.00±1.10d)(p<0.05)。
圖3兩組動物傷口愈合情況A和愈合時間B
3.2.組織病理學(xué)
3.2.1傷口長度
皮膚組織病理分析結(jié)果(圖4)顯示，在第7天，蒸餾水組和富氫水組創(chuàng)面長度仍較大，創(chuàng)面覆蓋肉芽組織。第14天，富氫水組的皮膚創(chuàng)面長度明顯小于蒸餾水組，并顯示出更好的再上皮化(p<0.05)。
圖4HE染色顯示皮膚損傷長度
3.2.2愈合情況
富氫水組沿創(chuàng)面邊緣可見新上皮形成，角化細(xì)胞分化、表皮細(xì)胞分化、表皮發(fā)育、皮膚發(fā)育、角化。第14天，蒸餾水組出現(xiàn)未分化角質(zhì)形成細(xì)胞。第21天，富氫水組上皮平坦度、腺體形成和上皮厚度明顯降低，而蒸餾水組上皮厚度不規(guī)則(圖5A)富氫水組在第28天完成再上皮化，出現(xiàn)結(jié)締組織，表明瘢痕組織的出現(xiàn)。第14天，富氫水組的平均表皮厚度(153.42±31.72μm)顯著低于蒸餾水組(193.28±45.80μm)(p<0.05;圖5B).第21天，富氫水組的平均表皮厚度(54.16±2.53μm)顯著低于蒸餾水組(123.54±46.14μm)(p<0.01)。第28天，所有皮膚創(chuàng)面均愈合，富氫水組與蒸餾水組平均表皮厚度無顯著差異。
圖5HE染色顯示兩組動物不同階段皮膚損傷病理改變特征。
3.2.3新血管形成
富氫水和蒸餾水組的新生血管結(jié)構(gòu)在第7天達(dá)到最大值，但隨著時間的延長新生血管結(jié)構(gòu)逐漸減少(圖5A、C、表4)。第7天，富氫水組新生血管結(jié)構(gòu)數(shù)目(17.60±1.14)明顯高于蒸餾水組(8.60±2.97)(p<0.01)。第21天，富氫水組新生血管結(jié)構(gòu)數(shù)(1.20±0.84)與蒸餾水組(3.20±0.81)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01;圖5C,表4)。
3.2.4。膠原蛋白纖維
Masson三色染色后，膠原纖維染色為藍(lán)色，肌纖維染色為紅色。病理切片結(jié)果顯示，兩組的膠原纖維隨著時間的推移而增加(圖6)。富氫水組的膠原纖維在第21天正常配置，直到第28天與健康皮膚相似。蒸餾水組在第7~21天膠原纖維呈交錯和不規(guī)則分布，少于富氫水組。第28天，蒸餾水組出現(xiàn)致密的不規(guī)則膠原纖維沉積。
圖6Masson染色結(jié)果
圖7氧化指標(biāo)數(shù)據(jù)(略)
圖8PCR分析結(jié)果(略)
3.3.氧化應(yīng)激檢測
實驗期間，小鼠皮膚組織(圖7一個,表5)先升高(第7~14天)，后降低(第14~28天)。第7天，蒸餾水組皮膚組織MDA水平(31.05±4.51U/mg)明顯低于富氫水組(17.68±2.48U/mg)(p<0.01)。第14天，蒸餾水組MDA水平(41.40±2.74U/mg)顯著高于富氫水組(17.47±2.82U/mg)(p<0.01)。第21~28天，皮膚組織中MDA水平急劇下降，兩組間無顯著差異(p>0.05)。
實驗期間，小鼠皮膚組織(圖7B,表6)從第7天開始升高至第28天，而富氫水組則先降低(第7天至第14天)后升高(第14天至第28天)。第7天，蒸餾水組皮膚組織SOD水平(12.36±0.96U/mg)明顯高于富氫水組(22.82±1.57U/mg)(p<0.05)。第21天，蒸餾水組SOD水平(23.36±4.04U/mg)顯著低于富氫水組(31.23±6.13U/mg)(p<0.05)。第28天，蒸餾水組SOD水平(24.39±2.87U/mg)顯著低于富氫水組(33.78±7.11U/mg)(p<0.05)。 
Nrf-2基因在富氫水/蒸餾水比值中的表達(dá)在第7~21天差異顯著，在第14天差異顯著(圖7C)。HO-1基因在富氫水/蒸餾水比值中的表達(dá)在第7天和第21天有顯著差異(圖7D)。NQO-1基因在富氫水/蒸餾水比值中的表達(dá)在第7天和第21天有顯著差異，在第14天有顯著差異(圖7E)。 
3.4.生長因子檢測
富氫水/蒸餾水比值中VEGF基因表達(dá)在第7天和第14天有顯著差異(圖8A)。PDGF在富氫水/蒸餾水比值中的基因表達(dá)在第7天和第14天也有顯著差異(圖8B)。
4.討論
在本研究中，我們確定了富氫水治療對狗的皮膚傷口愈合的積極作用，這主要歸因于其抗氧化潛力。皮膚傷口愈合的金標(biāo)準(zhǔn)評估包括肉眼檢查傷口表面的上皮和皮膚傷口大小隨時間的減少。最近的研究表明，雌激素可能在分子水平上參與創(chuàng)面愈合過程。因此，在這項研究中使用的狗都是完整的雄性，以避免不同水平的雌激素。富氫水治療方案在第7天至第28天顯示出實質(zhì)性效果;皮膚創(chuàng)面面積均小于蒸餾水組。氫水發(fā)現(xiàn)促進(jìn)肉芽組織的快速形成比蒸餾水組縮短恢復(fù)時間,這可能是由于富氫水促進(jìn)血管的形成在傷口愈合的早期階段和相對快速愈合的。在這里，富氫水上調(diào)抗氧化基因和生長因子基因的表達(dá)，促進(jìn)傷口愈合。此外，在第7-14天，富氫水組創(chuàng)面長度也明顯短于蒸餾水組(圖4)。
膠原纖維是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在組織中起結(jié)構(gòu)支架的作用，在皮膚創(chuàng)面愈合過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移。因此，膠原纖維的含量是檢測皮膚創(chuàng)面愈合的重要參數(shù)。氫水組織表明,皮膚內(nèi)的膠原纖維傷口網(wǎng)站觀察更常規(guī)和更高的內(nèi)容相比蒸餾水組(圖6)從天7和21日。調(diào)節(jié)基因表達(dá)在PDGF刺激膠原蛋白合成和膠原酶的釋放(圖8b)。因此，PDGF基因表達(dá)升高導(dǎo)致富氫水組膠原纖維數(shù)量多于蒸餾水組。這也解釋了為什么富氫水治療后皮膚組織中的膠原纖維增加，可能是富氫水介導(dǎo)的皮膚傷口愈合的主要原則之一。
在皮膚創(chuàng)面愈合的早期階段，炎癥反應(yīng)隨后創(chuàng)面區(qū)域再次上皮化，肉芽組織的建立伴血管新生。新生血管對傷口愈合和組織修復(fù)也很重要。新生血管為傷口提供營養(yǎng)和氧氣，支持角質(zhì)形成細(xì)胞遷移，將間充質(zhì)干細(xì)胞運送到皮膚，然后支持傷口再生。血管生成是一個由多種血管生成因子共同協(xié)調(diào)的過程，其中VEGF是調(diào)節(jié)血管生成過程關(guān)鍵步驟[36]的重要生長因子。同時，PDGF通過招募周細(xì)胞調(diào)節(jié)血管生成，促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合。在我們的實驗中,VEGF基因表達(dá)的(圖8),PDGF(圖8b)兩組表明,氫水組織表現(xiàn)出增強(qiáng)的能力為新血管形成的早期階段的皮膚傷口愈合(鹿)和符合的結(jié)果的新生血管性組織切片(表4圖5a、C)。因此,富氫水對皮膚創(chuàng)面血管生成的影響可能是通過增加VEGF和PDGF的表達(dá)，促進(jìn)肉芽組織的形成來調(diào)控的。研究表明，VEGF在軟骨內(nèi)骨形成的早期階段增加軟骨形成，導(dǎo)致骨形成和骨愈合[38]顯著增強(qiáng)。Fan等發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜修復(fù)中，VEGF阻斷顯著抑制了再上皮化。VEGF表達(dá)升高可促使皮膚創(chuàng)面再上皮化。因此，VEGF基因表達(dá)升高和血管新生是皮膚創(chuàng)面愈合過程中的積極信號。
Nrf-2是抗氧化反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，可避免氧化損傷和氧化應(yīng)激的發(fā)生。MDA是氧自由基對不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化作用的代謝物，間接反映了自由基損傷的嚴(yán)重程度。MDA水平的變化反映了組織中氧自由基含量的變化。SOD作為自由基的清除劑，其活性也反映了自由基[41]的數(shù)量。富氫水的抗氧化作用對促進(jìn)傷口愈合至關(guān)重要。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)富氫水可激活Nrf-2抗氧化途徑，并影響狗皮膚組織中SOD活性和MDA水平。
NQO-1和HO-1基因是Nrf-2的下游靶點，這兩個基因受Nrf-2表達(dá)的調(diào)控，被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化機(jī)制之一.研究表明，氫分子可以激活肺組織中Nrf-2的表達(dá)，從而促進(jìn)HO-1和NQO-1的表達(dá).在我們的研究中，富氫水處理增加了Nrf-2的表達(dá)(圖7C，第7天至第21天)，然后上調(diào)其下游II期代謝酶HO-1(圖7D，第7至21天)和NQO-1(圖7E，從第7天到第21天)。Nrf-2可以觸發(fā)SOD的轉(zhuǎn)錄，降低皮膚組織中MDA的含量.本試驗第7~14天，蒸餾水組MDA含量顯著高于富氫水組(p<0.01)，且富氫水組SOD活性顯著高于蒸餾水組(p<0.05)。MDA作為氧化反應(yīng)中間體之一，是脂肪酸氧化的標(biāo)志;它的水平升高可能導(dǎo)致老鼠皮膚傷口受損和延遲愈合.Li等發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷脂質(zhì)過氧化和SOD表達(dá)的增強(qiáng)促進(jìn)了慢性潰瘍創(chuàng)面愈合.在糖尿病模型中，創(chuàng)面微環(huán)境中促炎細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激的增加導(dǎo)致創(chuàng)面愈合延遲.這說明SOD的活性反映了皮膚組織的氧化水平，較低的氧化水平可以避免氧化損傷，導(dǎo)致更快的愈合。Ohsawa等報道動物吸入2%氫氣可清除羥自由基(OH)和過氧亞硝酸鹽陰離子(ONOO-)，從而改善氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷.SOD可以催化超氧陰離子分解為氧和過氧化氫，這一步也需要氫的參與。富氫水為SOD提供更多的氫，參與氧自由基的清除;因此，富氫水通過增強(qiáng)SOD活力，清除羥自由基和超氧自由基，從而降低MDA含量，促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合。
5.結(jié)論
口服富氫水可增加肉芽組織血管數(shù)量，加速創(chuàng)面上皮形成，縮短創(chuàng)面愈合時間。富氫水可以增強(qiáng)狗的抗氧化能力，激活Nrf-2信號通路的表達(dá)，提高M(jìn)DA、VEGF、PDGF的表達(dá)，降低SOD的表達(dá)。這些狗在遵循治療策略時沒有表現(xiàn)出不適。這些結(jié)果表明，富氫水是一種安全、有效的獸醫(yī)臨床治療犬皮膚傷口的方法。
該研究來自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院。
QiDD,DingMY,WangT,et al.TheTherapeutic Effectsof Oral In take of Hydrogen Rich WateronCut aneous Wound Healingin Dogs[J]. Veterinary Sciences, 2021,8(11):264. 如需氫健康類產(chǎn)品批發(fā)定制歡迎聯(lián)系13365334752或掃碼進(jìn)行咨詢/以上產(chǎn)品價格批發(fā)價格詳詢
|
