腎臟器官移植是終末期腎臟疾病的最理想治療方法。但是腎臟器官移植過程中無法避免缺血再灌注損傷，而且在移植腎臟后期和長期功能改變中均發(fā)揮重要影響。另外，來自心臟死亡供體的器官要面臨冷缺血時間危及移植后腎臟存活的潛在危險因素。冷缺血時間12小時以內(nèi)是移植腎臟存活的關(guān)鍵，但是大多數(shù)心臟死亡供體的器官都超過這個冷缺血時間。器官缺血時能量物質(zhì)供應(yīng)和需求不平衡導(dǎo)致組織缺氧和微血管功能異常，再灌注進(jìn)一步增強(qiáng)固有/適應(yīng)性免疫反應(yīng)和細(xì)胞死亡過程。因此，優(yōu)化體外器官保護(hù)手段能減少缺血再灌注損傷、提高移植器官存活率和長期治療效果。
缺血再灌注引起腎臟器官損傷的主要因素之一是毒性氧自由基的產(chǎn)生，毒性氧自由基過度產(chǎn)生可以導(dǎo)致DNA受損、蛋白氧化和硝基化、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞凋亡等細(xì)胞損傷。最近Ohsawa等證明氫氣通過減少細(xì)胞毒性氧自由基對腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。Shingu等證明靜脈注射氫氣飽和生理鹽水可減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷。早期的研究發(fā)現(xiàn)，添加氣體可以改進(jìn)器官保護(hù)液功能。Nakao等證明一氧化碳溶解在威斯康星大學(xué)溶液中可保護(hù)大鼠心臟冷缺血再灌注損傷。本研究假設(shè)威斯康星大學(xué)溶液中溶解氫氣可以保護(hù)腎臟冷缺血再灌注損傷。
研究結(jié)果
1、制備氫氣器官保護(hù)液
這個研究提供了一種新型的氫氣溶解方法（技術(shù)模擬圖(Fig. 1A) MiZ Co., Ltd., Kanagawa, Japan，曾有人使用這個技術(shù)制備給人注射用的氫氣飽和生理鹽水）。他們用灌滿器官保護(hù)液的離心管浸泡在氫氣飽和溶液中，溫度保持在5度，氫氣從氫氣飽和溶液（1.60 mg/L）通過管壁擴(kuò)散到灌滿器官保護(hù)液，48小時后保護(hù)液中氫氣濃度可以達(dá)到1.32 mg/L(Fig. 1B)。然后把腎臟放入離心管，隨后將該離心管繼續(xù)浸泡在5度氫氣飽和溶液中24小時，氫氣濃度仍可以達(dá)到1.39 mg/L（和放腎臟前1.32 mg/L無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Fig. 1C)）。在溶解氫氣的同時，不影響器官保護(hù)液內(nèi)的氧氣濃度（9.6 ±0.3vs. 9.5 ±0.4 mg/L，注意：這一點(diǎn)特別重要，如果采用氫氣加壓的技術(shù)，氧氣的濃度必然顯著下降）。
2、移植腎臟存活和腎臟功能改變
三組動物：直接移植（無冷缺血）、UW（無氫氣保護(hù)液）冷缺血組和HRUW（氫氣保護(hù)液）冷缺血組。不同冷缺血時間：24小時、36小時和48小時。存活100天結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無冷缺血組動物腎臟全部存活1， 24小時冷缺血組UW和HRUW無統(tǒng)計(jì)學(xué)區(qū)別（78.6% vs. 100%,）。36小時冷缺血組HRUW存活66.7%，遠(yuǎn)超過UW的20.0%。48小時冷缺血組UW和HRUW無統(tǒng)計(jì)學(xué)區(qū)別。（這個設(shè)計(jì)非常值得學(xué)習(xí)，我們一般在進(jìn)行設(shè)計(jì)的時候，往往是希望所有的指標(biāo)整齊劃一，但在實(shí)際情況下，由于損傷程度不同，損傷太少的，看不到死亡率的區(qū)別，死亡太大的，看不到治療效果的差別，死亡率有明顯區(qū)別，機(jī)制研究帶來災(zāi)難。作者進(jìn)行三種不同程度的區(qū)分，只發(fā)現(xiàn)36小死亡率的統(tǒng)計(jì)學(xué)改變，不影響進(jìn)行后續(xù)的深入研究，精彩的在后面）。
盡管24小時沒有死亡率的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（其實(shí)78.6% vs. 100%,也不錯，只要增加動物樣本數(shù)量，相信同樣可以有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的），作者對這一組動物進(jìn)行了腎臟功能的檢測，他們是在腎臟移植后90天進(jìn)行的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)。肌苷、肌苷清除率和24小時蛋白尿等指標(biāo)HRUW都顯著優(yōu)于UW。說明氫氣飽和保護(hù)液對長期的移植后腎臟功能影響是顯著的（這個處理非常聰明）。
3、氫氣保護(hù)液可以減少移植腎小管損傷和間質(zhì)纖維化
前面的研究提示氫氣保護(hù)液可以對24小時冷缺血后的移植腎長期功能產(chǎn)生明顯的保護(hù)。隨后他們對移植腎100天后的組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行了檢測，主要觀察到腎小管萎縮、擴(kuò)張、刷狀緣丟失、炎癥細(xì)胞浸潤和管型形成等。和普通的保護(hù)液相比，氫氣保護(hù)液可以顯著減少腎小管上述損傷（損傷評分下降）。間質(zhì)纖維化用馬森三色染色定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氫氣保護(hù)液可以顯著改善間質(zhì)纖維化。
4、氫氣保護(hù)液可以減少氧化損傷（特別注意動物分組和取材的時間點(diǎn)）
氫氣生物學(xué)效應(yīng)研究總無法排除氧化損傷的效應(yīng)觀察。隨后作者對冷缺血36小時移植后3小時的移植腎臟組織MDA和血清中8羥基鳥嘌呤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植腎臟組織MDA在氫氣保護(hù)液組明顯低于普通保護(hù)液組53.8 [14.3] vs. 37.7 [7.3] KM/g。但血清中8羥基鳥嘌呤無顯著性改變0.34[0.08] vs 0.29 [0.03]mg/L,P=0.524。
5、氫氣保護(hù)液對腎小管細(xì)胞碉亡和間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤的影響
因?yàn)闅錃獗Ｗo(hù)液可降低氧化損傷，隨后作者對腎小管細(xì)胞碉亡和間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤。這個實(shí)驗(yàn)是冷缺血36小時，移植后24小時取材（注意：這樣的設(shè)計(jì)決定于觀察指標(biāo)細(xì)胞碉亡巨噬細(xì)胞浸潤）。Tunel和ED-1免疫組織化學(xué)分別作為細(xì)胞碉亡和巨噬細(xì)胞浸潤的觀察指標(biāo)）。研究結(jié)果顯示，氫氣飽和保護(hù)液的效果超過普通的保護(hù)液。（這個研究可說明為什么氫氣可以增加存活率是因?yàn)闇p少了早期24小時的細(xì)胞碉亡和炎癥反應(yīng)。當(dāng)然，Tunel也不是單顯示細(xì)胞碉亡，這里無法排除細(xì)胞死亡的情況，甚至死亡更多更重要。）
6、基因表達(dá)和蛋白水平的研究
（為了使研究達(dá)到分子水平，總需要這樣的點(diǎn)綴。）這個內(nèi)容取材同實(shí)驗(yàn)5，也是冷缺血36小時，移植手術(shù)后24小時取腎臟組織。定量PCR結(jié)果顯示，干擾素g、白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子a、血紅素加氧酶1的mRNA沒有改變（盡管顯著高于正常組織）。不過趨化因子(C-C基元)配體2、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的mRNA都顯著下降，趨于正常。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的Western Blot結(jié)果符合mRNA的改變。
討論
1、氫氣可用于潛水作業(yè)，因此相當(dāng)安全。
盡管容易爆炸，但濃度只要不超過4.7%就不燃燒，自從Ohsawa發(fā)現(xiàn)氫氣可以中和自由基治療腦缺血后，氫氣治療各類疾病成為研究熱點(diǎn)。
2、氫氣可以呼吸，已經(jīng)證明呼吸氫氣可治療許多疾病。但呼吸的方法不方便日常使用，難以連續(xù)使用。喝氫氣飽和水是個辦法，研究也證明效果不凡。但喝水不容易確定劑量，給研究帶來一定麻煩。于是就有人開展注射氫氣鹽水，效果確實(shí)不錯。氫氣溶解的方法有通過加壓處理、通氣泡溶解的方法。我們的研究提供了一個新的技術(shù)，可以不影響包裝內(nèi)成分的前提下制備出氫氣飽和溶液。這個方法作氫氣水牛，他們稱為“非破壞性溶解氫氣技術(shù)”。因?yàn)椴恍枰蜷_包裝，可對目前使用的臨床制劑進(jìn)行加氫氣處理，不會使處理的溶液發(fā)生成分或微生物污染，就可以進(jìn)入臨床使用（廣告？）。
3、本研究首先評價了氫氣保護(hù)液可更加有效地保護(hù)體外保護(hù)器官。其作用可能是具有抗氧化作用。其中特別注意的是可降低iNos這樣可能具有抗硝基化的作用。
基因蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示該保護(hù)液體具有抗早期炎癥的作用，雖然對一些因子的改變沒有明顯改善，但對巨噬細(xì)胞相關(guān)的炎癥因子改變顯著，這正好符合巨噬細(xì)胞浸潤的結(jié)果。
研究中發(fā)現(xiàn)盡管器官移植后HO-1 mRNA增加，但氫氣沒有使之下降，說明這個模型中的效應(yīng)和HO-1沒有關(guān)系。（不過只測定mRNA，沒有蛋白和活性的分析，這個結(jié)論不夠嚴(yán)格。）
總之，這個研究發(fā)現(xiàn)，將氫氣溶解在器官保護(hù)液中，可以提高保護(hù)效果，主要是通過減少氧化損傷、降低炎癥反應(yīng)，減少早期細(xì)胞壞死和間質(zhì)纖維化，從而對移植腎臟的產(chǎn)生明顯的長期保護(hù)效果。 |
